东方山羊豆(Galega. orientalis L.)为豆科山羊豆属动物,是一种优良的饲用牧草。东方山羊豆产草量高,操纵年限长,抗逆、抗病性强,可口性好,具有推进奶牛产奶量和乳脂率的提高档功能,适宜建植人工草地取改良天然草地,正在我国“退耕还草、退牧还草、草田轮做”中使用前景将十分广漠,对东方山羊豆这些特征的深切研究和开辟利器具有很是主要的经济取生态意义。为了切磋东方山羊豆应对的机制,本论文开展了抗逆因子相关基因的分手、克隆以及表达特征阐发,并通过转基因手艺获得转基因植株,为切磋和改良牧草对非生物的耐性供给了理论根据和手艺保障。目前,取得如下的研究进展: 一、分手了1个冷的东方山羊豆ERF因子基因GoDREB全长序列,初步明白了其特征及功能。 1.采用RACE的克隆方式,从东方山羊豆中克隆到一个ERF类因子,将其定名为GoDREB。基因序列ORF区为1095bp,编码一个由364个氨基酸构成的卵白。序列阐发表白: GoDREB基因中具有一个内含子,长度为1332 bp,正在ORF的第255个核苷酸(T)取第256个核苷酸(A)之间; GoDREB基因具有ERF因子所特有的审定位信号、DNA连系域以及激活域;它取其他已知的ERF基因除了正在保守的AP2/EREBP布局域处具有很高的同源性外,正在其它的区域同源性也较高。GoDREB具有动物ERF因子典型的布局特征,是动物ERF因子家族的一个新,属于该因子家族的classIV亚族。 2.采用及时荧光定量PCR的方式,对东方山羊豆顺境下的表达特征进行阐发。尝试成果表白GoDREB正在东方山羊豆中的表达不只受低温、PEG和盐,并且也受外源激素MeJA和SA的;此中,受低温的变化较着早于PEG和盐,而对ABA的几乎没有响应,由此猜测GoDREB可能次要通过SA/JA路子参取对顺境的晚期防卫反映,而不依赖于ABA路子。使用半定量RT-PCR方式,阐发了GoDREB基因正在东方山羊豆分歧组织中的表达性,成果表白:东方山羊豆GoDREB基因正在三种组织中的表达存正在差别,比拟而言正在叶中的表达最强,正在茎中的表达较弱,而正在根中的表达量为最弱。GoDREB基因正在各个器官都具有必然的表达量申明它本身是一个构成型表达的基因。 3.通过度析证明GoDREB是定位正在细胞核。亚细胞定位成果表白,pCAMBIA1302-GoDREB-GFP融合卵白集平分布正在细胞核中,而对照pCAMBIA1302正在细胞核和细胞质中均有分布,证了然GoDREB具有审定位的特征。 4.获得了转GoDREB基因烟草植株。通过农杆菌介导法将GoDREB转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和RT-PCR判定。成果表白,GoDREB基因曾经整合到烟草基因组中,并可正在程度一般表达。 二、分手到1个冷的东方山羊豆RAV因子基因GoRAV全长序列,初步明白了其特征及功能。 1.通过RT-PCR和RACE方式,分手到1个冷的东方山羊豆RAV因子编码基因GoRAV, ORF区为1164bp,编码由387个氨基酸残基构成的RAV因子GoRAV。通过度析GoRAV基因的布局,证明正在该基因内部没有内含子。序列比对阐发表白,GoRAV是RAV因子家族的一个新。GoRAV取豆科动物大豆GmRAV的分歧性最高,取双子叶动物的RAV具有相对较高的同源性,而取票据叶动物的序列分歧性略低。 2.通过及时荧光定量PCR阐发了GoRAV正在顺境下的表达特征。尝试成果表白GoRAV基因正在东方山羊豆中可以或许被PEG和低温、以及外源动物激素ABA、SA和MeJA,初步猜测GoRAV可能通过ABA/MeJA信号传导路子参取东方山羊豆对顺境的防御反映。半定量RT-PCR方式阐发GoRAV基因正在东方山羊豆分歧组织中的表达性,成果表白:GoRAV基因正在三种组织中的表达存正在差别,正在根中不表达,正在茎和叶中均有较强的表达。 3.通过度析证明GoRAV是定位正在细胞核。亚细胞定位成果表白,pCAMBIA1302-GoRAV-GFP融合卵白集平分布正在细胞核中,而对照pCAMBIA1302正在细胞核和细胞质中均有分布,证了然GoRAV具有审定位的特征。 4.获得了转GoRAV基因烟草植株。通过农杆菌介导法将GoRAV转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和RT-PCR判定。成果表白,GoRAV基因已整合到烟草基因组中,并正在程度一般表达。

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